暗視野顯微鏡是利用丁達爾（Tyndall）光學效應的原理，在普通光學顯微鏡的結構基礎上改造而成的。暗視野聚光器，使光源的中央光束被阻擋。不能由下而上地通過標本進入物鏡。從而使光改變途徑，傾斜地照射在觀察的標本上，標本遇光發生反射或散射，散射的光線投入物鏡內， 因而整個視野是黑暗的。
暗視野顯微鏡常用來觀察未染色的透明樣品。這些樣品因為具有和周圍環境相似的折射率，不易在一般明視野之下看的清楚，於是利用暗視野提高樣品本身與背景之間的對比。這種顯微鏡能見到小至4~200nm的微粒子，只能看到物體的存在、運動和表面特徵，不能辨清物體的細微結構。
暗視野顯微鏡由於不將透明光射入直接觀察係統，無物體時，視野暗黑，不可能觀察到任何物體;當有物體時，以物體衍射回的光與散射光等在暗的背景中明亮可見。在暗視野觀察物體，照明光大部分被折回，由於物體(標本)所在的位置結構，厚度不同，光的散射性，折光等都有很大的變化。
普通顯微鏡下可以看到0.45um的細節，而暗視野顯微鏡下竟能看到0.2-0.004um的極徽小物體。這個範圍的物體叫亞粒子，因此暗視野顯微鏡也可以稱裂隙限外顯微鏡。暗視野顯微鏡特別適用於膠體化學領域中觀察溶質粒子的布朗運動，適用於觀察原蟲、細菌的鞭毛、偽足運動，醫學檢驗學範圍適用於觀察人體體液中螺旋體、尿管形、結晶或粒子。在這一點上，暗視野顯微鏡遠比其他種類顯微鏡要得多。